Antibiograma por método de difusión en agar
¿Qué es un antibiograma?
El antibiograma corresponde a una prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad de una colonia bacteriana a un antibiótico o grupo de antibióticos. Este permite definir para cada antibiótico, si la bacteria es sensible, intermedio o resistente. Además, se puede pesquisar la capacidad de un antibiótico a inhibir el crecimiento bacteriano. Por lo tanto, evalúa la eficacia de un antibiótico sobre una bacteria.
Objetivos:
- Establecer planes terapéuticos personalizados.
- Elaborar programas orientados al uso racional de antibióticos.
¿Por qué se realiza el antibiograma?
En muchas ocasiones, ante infecciones comunes, no se suele emplear el antibiograma, sino un tratamiento empírico que suele tener un mayor espectro de acción.
Pero en ciertas situaciones en las que la patología se sospecha de gravedad o no responde al tratamiento empírico, se debe realizar el antibiograma tras la obtención de los cultivos e identificado el patógeno causante, de forma que el tratamiento será dirigido y más eficaz.
¿Por qué no se realiza un antibiograma?
Existen diversas dificultades que impiden la realización de un antibiograma, algunas de ellas son:
El tiempo requerido para el cultivo: Existen algunas bacterias que requieren un tiempo de incubación más prolongado. Por lo tanto, si se espera ese período, el tratamiento puede ser tardío para combatir el cuadro clínico asociado.
No todos los cultivos muestran el agente causal
La contaminación puede distorsionar los resultados
¿Cómo se realiza un antibiograma por método de difusión en agar?
- Selección de colonias
Se deben seleccionar de 3-5 colonias del organismo que se está evaluando para así tener una mayor oportunidad de detectar resistencia. En el caso de no disponer de colonias aisladas, realizar un subcultivo de la bacteria en una nueva placa.
- Preparación y estandarización del inóculo
Las suspensiones deben ser realizadas en suero fisiológico o caldo Mueller-Hinton y homogeneizadas en un vórtex.
La turbidez de la suspensión bacteriana a inocular se debe estandarizar a 0,5 de la escala Mc Farland, su medición puede ser realizada a través de un turbidímetro o puede ser comparada directamente con el control (0,5 de Mc Farland) bajo luz transmitida.
Luego del ajuste de turbidez, las suspensiones deben ser utilizadas como inóculo dentro de 15 minutos.
¡Precaución!
- Una mayor densidad del inóculo implica una menor inhibición, lo que se informaría como una falsa resistencia.
- Una menor densidad del inóculo implica una mayor inhibición, entregando una falsa sensibilidad.
- Inoculación de las placas
Antes de inocular las placas estas tienen que adquirir la temperatura ambiente para que el exceso de humedad se absorba dentro del medio, esto se puede hacer colocándolas entreabiertas en la estufa de cultivo entre 10 y 15 minutos.
Es importante que las placas tengan una profundidad de 4 mm y pH entre 7,2 a 7,4.
Se debe sumergir un hisopo de algodón estéril en la suspensión (previamente agitada para que esté homogénea) y se remueve el exceso presionándolo contra la pared del tubo para luego inocular frotando el hisopo de ida y vuelta por toda la placa 3 veces en 3 direcciones diferentes cada 60° aproximadamente.
- Aplicación de discos antimicrobianos
Los discos se deben retirar del congelador o refrigerador mínimo un hora antes de realizar la inoculación para que se ajusten a la temperatura ambiente.
Los discos con antimicrobianos tienen que aplicarse dentro de los 15 minutos posteriores a la inoculación. Se puede realizar manualmente o a través de un dispensador de discos. Si se realiza de forma manual, se deben presionar los discos para asegurar su adherencia a la superficie del agar.
Se pueden aplicar máximo 12 discos en una placa de 150 mm de diámetro y máximo 6 en un placa de 100 mm. La distancia óptima entre ellos medida desde sus centros es de 24 mm.
¡Precaución!
- Presionar cada disco firmemente para asegurar el contacto completo con la superficie de agar y que no terminen en la tapa de la placa durante la incubación.
- Luego de cada aplicación de un disco se debe esterilizar la pinza utilizada.
- Nunca reubicar los discos una vez que tomaron contacto con la superficie del agar.
- Usar productos validados para diagnóstico in vitro.
- El almacenamiento adecuado es a -20ºC en envases herméticos e impermeables con desecador.
- No usar discos después de su fecha de vencimiento.
- Utilizar discos con el contenido de antimicrobiano especificado en los estándares de CLSI.
- Incubación de la placa de agar
Posterior a la inoculación y aplicación de discos se deben tapar las placas para incubarlas de forma invertida.
Para bacterias fastidiosas se usan condiciones específicas de incubación recomendadas por el CLSI.
Para bacterias no fastidiosas se debe incubar a 35°C +/- 2 por 16-18 horas o 24 horas.
Medición de las zonas de inhibición
*El agar MH se aprecia de color verde debido a la pigmentación (pioverdina) que produce la cepa de Pseudomonas aeruginosa.
Después de retirar la placa de la incubadora, esta se debe examinar para verificar que el crecimiento sea uniforme y confluente, de tal modo que permita obtener halos de inhibición simétricos y definidos.
Medir redondeando (aproximando) al milímetro más cercano con una regla o un pie de metro.
Medición usando luz reflejada
La placa se ubica sobre un fondo oscuro y se ilumina desde un nivel superior con una lámpara.
- La luz reflejada es usada para Enterobacteriaceae, como E. coli, otros bacilos gram negativos, Staphylococcus y Enterococcus (excepto para vancomicina).
- La luz reflejada también es usada cuando se miden zonas de inhibición en agar Mueller-Hinton sangre (Streptococcus spp).
Sugerencia: Cuando analice Streptococcus spp en agar Mueller-Hinton con 5% de sangre de cordero, retire la tapa y mida las zonas desde la parte superior de la placa.
Medición usando luz transmitida
La placa se ubica de tal forma de que la luz de la lámpara le llegue desde la parte posterior y se debe considerar el desarrollo al interior del halo el cual puede pasar desapercibido si se utiliza luz reflejada.
Se utiliza la luz
transmitida, cuando mida zonas de:
- Enterococcus spp con vancomicina y linezolid.
Los antibiogramas por
difusión para Enterococcus spp se deben leer a las 16-18 horas
aproximadamente, excepto el disco de vancomicina y linezolid que se lee a las
24 horas de incubación.
Interpretación de resultados
Cada halo alrededor del disco debe ser leído cuidadosamente, midiendo el diámetro en milímetros con una regla o pie de metro. El resultado de esta medición se interpreta basándose en los puntos de corte tabulados en las tablas CLSI las cuales contienen los criterios Resistente, Intermedio, Sensible o No susceptible, según corresponda para cada bacteria en estudio. Actualmente se ha incorporado la categoría de Susceptibilidad dosis dependiente (SDD) en el caso de Cefepime, solamente para Enterobacterias.
Sensible (S):
Una categoría definida por un punto de corte que implica que los aislamientos con un diámetro de zona por encima del punto de corte susceptible se inhiben por las concentraciones usualmente alcanzadas del agente antimicrobiano, empleando la dosis recomendada para tratar el sitio de infección, lo que resulta en probable eficacia clínica.
No susceptible (NS):
Una categoría utilizada para aislamientos para los que solo se designa un punto de corte susceptible debido a la ausencia o la rara aparición de cepas resistentes. Los aislamientos para los cuales los diámetros de zona de inhibición están por debajo del valor indicado como punto de corte susceptible deben informarse como no susceptibles.
Intermedio (I):
Una categoría definida por un punto de corte que incluye aislamientos con diámetros de zona dentro del rango intermedio, que se acercan a niveles de sangre y tejidos generalmente alcanzables y/o cuyas tasas de respuesta pueden ser más bajas que para aislamientos susceptibles.
Resistente (R):
Una categoría definida por un punto de corte que implica que los aislamientos con un diámetro de zona en o por debajo del punto de resistencia no están inhibidos por las concentraciones usualmente alcanzables del agente antimicrobiano en programas de dosificación normales, por tanto, la eficacia clínica no se ha demostrado de manera confiable en los estudios de tratamiento.
Susceptibilidad dosis dependiente (SDD):
Una categoría definida por un punto de corte que implica que la susceptibilidad de un aislado depende del régimen de dosificación que se utiliza en el paciente. Para lograr niveles que probablemente sean clínicamente efectivos contra los aislamientos, es necesario usar un régimen de dosificación (es decir, dosis más altas, dosis más frecuentes, o ambas) que resulte en una exposición al fármaco más alta que la lograda con la dosis que se usó para establecer el punto de corte susceptible.
Escala de Mc Farland (etalón)
Son patrones de turbidez hechos de sulfato de bario y se utilizan en la preparación de suspensiones de microorganismos.
La escala de Mc Farland va de 0,5 a 10. Para las pruebas de sensibilidad antimicrobiana se utiliza el patrón 0,5 de Mc Farland que corresponde a 1,5 x 10⁸ UFC/mL.
- Preparación del estándar 0,5 de Mc Farland: 0,5 mL BaCl2 al 1,175% + 99,5 mL H2SO4 al 1%.